Действие I
Монархическая Италия 1800 года. Бежавший из крепости политический узник Чезаре Анджелотти нашёл убежище в церкви. Здесь, в фамильной капелле его сестры маркизы Аттаванти, спрятана одежда, в которую он должен переодеться и бежать из Рима от преследования начальника полиции барона Скарпиа.
В церкви работает художник Марио Каварадосси. Очарованный обликом молящейся Анжелотты (сестры Чезаре), он неосознанно пишет с неё кающуюся грешницу Магдалину. Неожиданно художник видит выходящего из капеллы человека и с изумлением узнаёт в нём своего прежнего друга Анджелотти. Беглец обращается к Марио с мольбой о помощи. Приближение Тоски заставляет его спрятаться. Рассеянность Каварадосси зарождает в Тоске подозрения, а замеченное ею сходство портрета Мадонны с внешностью маркизы вызывает в ней ревность. Лишь пылкие уверения художника в любви на время успокаивают Тоску.
После её ухода Каварадосси предлагает Анджелотти, дождавшись момента, спрятаться на вилле. Раздаётся выстрел тюремной пушки, возвещающий о побеге заключённого. Художник торопит Чезаре покинуть церковь через тайный ход и бежать на виллу.
Церковь наполняется хористами и народом: пришла весть о победе над войсками Наполеона. Начинается торжественное богослужение. В толпе неожиданно появляются шеф полиции Скарпиа и его подручные, разыскивающие бежавшего узника. Барон догадывается, что Анджелотти был здесь, а Каварадосси пытается скрыть его от полиции. Скарпиа намерен использовать сложившуюся ситуацию в своих целях: поймать беглеца, отправить в тюрьму Каварадосси и добиться расположения его давней страсти — певицы Флории Тоски. Найденный веер Анжелотты, а также её сходство с изображением Мадонны помогают Скарпиа разжечь огонь ревности в душе Флории, и она в негодовании отправляется на виллу Каварадосси. Следом за Тоской Скарпиа посылает двух сыщиков: она приведёт их к беглецу.
Действие II
В своём кабинете в палаццо Фарнезе Скарпиа ждёт донесений. Охваченный любовным вожделением, он передаёт Тоске через подчинённого приглашение явиться к нему. Входит посланный следить за певицей агент Сполетта. Он сообщает, что обыск виллы не дал результатов. Скарпиа велит привести арестованного художника, который должен сказать, где скрывается беглец. Каварадосси мужественно отвергает попытки вынудить его к признанию и успевает напомнить появившейся Тоске о необходимости хранить молчание. Тщетно пытается Скарпиа выведать у неё тайну. Лишь крики пытаемого художника лишают Флорию самообладания, и она рассказывает, где прячется Анджелотти. Полицейские вносят измученного Каварадосси. Из приказа Скарпиа, посылающего сыщиков к колодцу, художник понимает, что полицейскому удалось выведать у Тоски местонахождение друга. В гневе он проклинает свою возлюбленную.
В этот момент Сполетта приносит весть, что победа оказалась мнимой и армия Наполеона приближается к Риму. Воспрянувший художник пытается напасть на шефа полиции, но его хватают и уводят.
Скарпиа предлагает Тоске позорную сделку. Он сохранит Каварадосси жизнь и свободу, если Флория будет к нему благосклонна. Она с возмущением отвергает эти гнусные притязания. Скарпиа продолжает свои уговоры. Взамен на согласие он обещает, что расстрел будет проведён холостыми патронами. Спасение Каварадосси — единственное, что сейчас волнует Флорию, и она соглашается. По настоянию Тоски Скарпиа пишет сопроводительное письмо в крепость и даёт гарантию, что она вместе с Марио Каварадосси сможет беспрепятственно покинуть Рим. Он пытается заключить Тоску в свои объятия, но внезапно получает от неё удар кинжалом и умирает.
Действие III
Рассветные сумерки. На площадку крепостной башни (место казни заключённых) приводят Каварадосси, которому остался час до расстрела. Марио пишет прощальное письмо возлюбленной.
Вбегает Тоска. Она рассказывает художнику, что расстрел его будет не настоящим. Услышав выстрелы, он должен упасть, сделав вид, что убит; после ухода солдат они убегут. Убеждённый в благополучном исходе, Каварадосси спокойно встаёт перед нацеленными дулами ружей. Гремит залп, и он падает. Солдаты уходят. Флория бросается к возлюбленному, но он не откликается на её зов. Марио мёртв. Приказ Скарпиа стрелять холостыми патронами оказался обманом и его последней местью.
Тоску окружают преследователи, узнавшие об убийстве Скарпиа. Чтобы не попасть в руки палачей, она, полная решимости, подбегает к краю башни — лишь смерть может соединить её с Каварадосси!
