Место действия — Украина. Время — начало XVIII века.
Действие первое
Картина первая
Дом и сад Кочубея.
Девушки приходят к Марии, дочери Кочубея, и зовут её с собою погадать о суженом. Мария отказывается: у отца в гостях гетман Мазепа, которого она любит.
Друг её детства казак Андрей, зная о тайной страсти Марии, признаётся тем не менее ей в беззаветной любви и уговаривает забыть Мазепу. Мария, понимая всю безрассудность своего чувства, всё же не в состоянии бороться с ним.
В сад выходят Кочубей, его жена Любовь, Мазепа и гости. Слуги Кочубея развлекают Мазепу песнями и плясками.
Мазепа просит у Кочубея руки Марии. Кочубей и Любовь возмущены предложением старого гетмана — крёстного отца Марии. Гетман обращается к Марии и предлагает выбор между собой и родителями. Она после мучительных колебаний отдаёт свою руку Мазепе. Гетман увозит Марию.
Картина вторая
Комната в доме Кочубея.
Мать Марии оплакивает дочь, покинувшую отчий дом. Она торопит мужа отомстить Мазепе. Кочубей объявляет план мщения: он узнал о связях гетмана со шведским королем Карлом XII, о готовящейся измене Мазепы Петру I и решил выдать гетмана русскому царю.
Андрей готов отдать донос в руки царя. Единомышленники Кочубея полны ненависти к гетману Мазепе.
Действие второе
Картина третья
Подвал в Белоцерковском дворце Мазепы.
Лживый гетман, предупреждённый о доносе приближёнными Петра I, успел оклеветать Кочубея перед царем. Закованные в цепи и истерзанные, Искра и Кочубей ждут допроса.
Входит Орлик — приближённый гетмана. Он требует у Кочубея выдачи клада, будто бы закопанного им в его деревне Диканьке.
Ничего нет у Кочубея: его честь — поругана Мазепой, любимая дочь — отнята у него Мазепой.
Только одного жаждет Кочубей — мести.
Картина четвертая
Комната во дворце Мазепы.
Гетман тайно принимает послов шведского короля. Входит Орлик, которому он отдаёт приказ о казни Кочубея.
Появляется Мария. В разговоре с Мазепой она упрекает его в холодности к ней. Ревнивые подозрения томят её душу. Нехотя гетман вынужден открыть истинную причину его холодности, он открывает ей тайну заговора против русского царя. Мазепа хочет знать, кого бы Мария предпочла — отца или супруга, если бы ей пришлось делать выбор? В смятении она говорит о беспредельности своей любви, ей непонятен выбор, который предлагает Мазепа. Мазепа уходит.
Тайком пробравшаяся во дворец гетмана, появляется мать Марии, она рассказывает дочери о неудавшемся доносе на Мазепу и потрясена тем, что дочь не знает о готовящейся казни отца. Мария и Любовь спешат остановить казнь.
Картина пятая
Дорога, ведущая к месту казни Кочубея.
Народ ждёт появления обречённых, в толпе поёт и пляшет пьяный казак. Проходят палач, затем Мазепа с Орликом, затем ведут Кочубея и его друга Искру. Осуждённые прощаются друг с другом, с народом и жизнью и идут к эшафоту.
Вбегают Мария и Любовь. Но они опоздали. Казнь свершилась.
Действие третье
Картина шестая
Полтавский бой — симфоническая картина
Картина седьмая
Бывший дом и сад Кочубея.
Разгар боя, русские воины преследуют шведов, среди них — Андрей. Он останавливается и вспоминает прошлое, в котором был счастлив. Появляются Мазепа и Орлик. Они бегут с поля сражения под Полтавой. Андрей, увидев Мазепу, бросается на него с ca6лей, но Мазепа опережает Андрея и, выстрелив, смертельно ранит.
Появляется лишённая рассудка Мария, она ничего не узнаёт вокруг. Подавленная горем дочь страдает о казнённом отце.
Орлик и Мазепа скрываются. Не узнавая умирающего Андрея, Мария убаюкивает его колыбельной песней.
